Ultracentrifuga

Ultracentrifugii este o centrifugă optimizat pentru viteze mari . Ultracentrifuge Modern (UZ) se poate realiza accelerații de până la 10 ⁶ g și viteze de până la 150.000 de rotații pe minut.

UZ este un instrument de laborator extrem de important și este imposibil să ne imaginăm multe domenii ale cercetării științifice fără el. În biologia celulară , biologia moleculară și microbiologie este utilizată pentru fracționarea și purificarea componentelor celulare, în nanotehnologie pentru purificarea și separarea nanoparticulelor .

Se face o distincție generală între două tipuri de ultracentrifuge, cea preparativă și cea analitică .

Domeniile de aplicare a UZ preparativ includ mai presus de toate peletizarea și purificarea fracțiunilor de particule fine, cum ar fi organele celulare , proteine , viruși etc.

Ultracentrifugii analitică a fost dezvoltat de către Svedberg la mijlocul anilor 1920 . Este utilizat în principal pentru a determina coeficienții de sedimentare și greutățile moleculare . Astfel, oferă informații despre forma, modificările conformaționale, distribuțiile de mărime și interacțiunile macromoleculelor .

Structura și principiul funcționării

UZ separă particulele dizolvate prin forțe centrifuge puternice generate într-un rotor rotativ . Procesul de separare depinde de proprietățile de sedimentare ale particulelor (vezi și viteza de sedimentare ). Acestea sunt determinate de diverși factori, dar mai ales de mărimea, densitatea și forma particulelor. În timpul UZ, forțe centrifuge extrem de mari acționează asupra particulelor. Acesta este motivul pentru care particule foarte mici pot fi, de asemenea, separate. Forțele centrifuge puternice sunt posibile prin structura specială a UZ. Spre deosebire de alte centrifuge, rotorul este situat într-o cameră de vid. Datorită vidului , rotorul nu mai experimentează nicio rezistență la aer în timp ce funcționează și poate astfel atinge accelerații și viteze foarte mari. Căldura generată efectiv de mișcarea rotorului este prevenită prin răcirea camerei de vid. Temperatura camerei de vid poate fi reglată liber și astfel adaptată în mod optim probei deseori sensibile.

În UZ pregătitor și analitic, se utilizează tipuri speciale de rotor. Analizorul UZ este, de asemenea, echipat cu un sistem optic de măsurare.

Ultracentrifugare preparativă

UZ preparativ este utilizat pentru a separa particulele în funcție de mărimea lor ( granulare simplă și diferențială , sedimentare zonală) sau densitatea lor ( centrifugare în gradient de densitate izopicnică ). UZ-urile utilizate în scopuri pregătitoare ating cele mai mari accelerații și cele mai mari viteze, până la 10 ⁶ g și până la 150.000 de rotații pe minut (rpm).

În UZ pregătitoare sunt utilizate două tipuri de dispozitive: ultracentrifugele mari, de podea (Fig. 1) și ultracentrifugele de masă (Fig. 2). Datorită rotoarelor mai mici, ultracentrifugele de pe masă ating viteza cea mai mare. De aceea sunt folosite pentru purificarea particulelor deosebit de mici, cum ar fi subunitățile ribozomale. Totuși, când este vorba de volume mai mari de probe, se utilizează ultracentrifuge (ultracentrifugă de masă: până la aproximativ 195 ml; ultracentrifugă: până la aproximativ 560 ml). Acestea atinge accelerații de până la 8 × 10 ⁵ g și viteze de 100.000 rpm.

Un tip special de ultracentrifugă de masă este așa-numitul airfuge. Rotorul său este acționat de aer comprimat și poate atinge viteze de până la 110.000 rpm în 30 de secunde. Prin urmare, Airfuge este adesea utilizat atunci când este necesară prelucrarea deosebit de rapidă a particulelor probei, de ex. B. dacă proba este un complex receptor- ligand instabil .

Rotoare

Este crucial pentru rezultatul cu succes al unui experiment ca toate materialele utilizate la UZ să fie potrivite în mod optim între ele și cu cerințele eșantionului. Alegerea rotorului are o importanță centrală aici. Cel mai bun rezultat posibil se obține atunci când rotorul curăță sau concentrează particulele din probă cu eficiență maximă. Adesea, numai viteza sa maximă este privită ca o măsură a eficienței unui rotor. De fapt, performanța sa este determinată de mai mulți factori. Trei factori cheie sunt: ​​1) unghiul la care sunt orientate eprubetele, 2) distanța de separare și 3) timpul de separare. O măsură simplă a eficienței globale a unui rotor care ia în considerare toți acești factori este ceea ce este cunoscut sub numele de factor k. Acest lucru rezultă după cum urmează:

${\ displaystyle k = {\ frac {2,53 \ times 10 ^ {5} \ times ln (r_ {max} / r_ {min})} {(rpm / 1000) ^ {2}}}}$

Cu cât factorul k este mai mic, cu atât eficiența rotorului este mai mare.

Există trei tipuri generale de rotoare: rotoare cu unghi fix, rotoare cu cupă oscilantă și rotoare verticale (Fig. 3). Cea mai notabilă diferență dintre ele este unghiul la care tuburile de probă sunt aliniate cu axa de rotație a rotorului în timp ce centrifuga funcționează și este în repaus. Cu rotoarele cu unghi fix, eprubetele sunt înclinate (între 20 ° și 45 °), cu rotoarele cu cupă oscilantă, probele sunt orizontale, iar cu rotoarele verticale, sunt verticale. Unghiul de orientare are o influență decisivă asupra creării efectelor de perete, care au un efect perturbator asupra formării benzilor de particule.

Unghiul de orientare determină și distanța de separare. Aceasta este distanța pe care trebuie să o parcurgă particulele eșantionului în tubul de eșantionare pentru a se peleta pe peretele tubului. Distanța de separare poate fi calculată din diferența dintre r _max (distanța dintre axa rotorului și fundul tubului) și r _min (distanța dintre axa rotorului și începutul tubului) (Fig. 3). Distanțele de separare pentru aceleași rotoare rezultă din diametrul tubului de probă și unghiul de orientare al tubului în timpul funcționării centrifugei.

Viteza maximă a unui rotor și r _{maxul acestuia} determină forța maximă de accelerație a rotorului. Un alt parametru important este r _min , care determină forța centrifugă asupra particulelor din partea superioară a tubului de probă.

Eprubete speciale de testare sunt utilizate în practică pentru a reduce factorul k al unui rotor și, astfel, pentru a spori eficiența acestuia. Aceste tuburi au un volum mai mic, ceea ce reduce distanța de separare. Sunt închise cu un distanțier. Ca rezultat, r _max rămâne neschimbat și, astfel, și accelerația maximă a rotorului.

Prin urmare, alegerea corectă a rotorului depinde de o serie de factori. Cu toate acestea, depinde în primul rând de aplicația planificată, de natura și volumul eșantionului și de procesul de separare necesar. Rotoarele cu unghi fix sunt utilizate în general pentru peletizarea eficientă și centrifugarea izopicnică a densității macromoleculelor. Rotoarele cu cupă oscilantă sunt utilizate în principal pentru centrifugarea densității izopicnice a celulelor și a organelor celulare, precum și pentru sedimentarea zonală. Rotoarele verticale sunt utilizate în principal în centrifugarea cu gradient de densitate fără formarea peletelor (Tabelul 1).

Forme speciale de rotor

Pe lângă cele trei tipuri de rotor menționate mai sus, există și câteva forme speciale ale rotorului vertical. Rotorul zonal și rotorul de curgere au o importanță deosebită aici (Fig. 4). Acestea au fost special dezvoltate pentru volume mari de eșantioane. Acestea sunt folosite pentru a separa particule mai mari de probă, cum ar fi bacterii, celule, organite celulare sau viruși de omogenate tisulare, dar devin tot mai importante în purificarea nanoparticulelor. Acești rotori au o aplicație importantă în fabricarea comercială a vaccinurilor.

Capacitatea mare a acestor rotoare (de 50 până la 100 de ori mai mare decât cea a unui rotor convențional cu cupă oscilantă) se realizează prin renunțarea la utilizarea vaselor individuale de probă. În schimb, proba este plasată direct în spațiul rotorului în cea mai mare parte cilindric. În rotoarele zonale, volumele mari de probă pot fi separate folosind centrifugarea cu gradient de densitate. Pentru a face acest lucru, mediul gradient este plasat direct în spațiul rotorului și apoi acoperit cu proba. Rotoarele de curgere sunt, de asemenea, echipate cu un sistem de pompare care permite soluției de probă să curgă continuu prin camera rotorului în timpul centrifugării. Acest lucru permite obținerea de eșantioane de până la nouă litri pe oră. Prin urmare, aceste rotoare sunt adecvate în special pentru sedimentarea sau concentrația particulelor mari de probă (> 50 S ) din soluții de probă foarte lichide. Printr-un proces de încărcare și descărcare special adaptat, rotoarele de curgere pot fi utilizate și pentru centrifugarea cu gradient de densitate.

O a treia formă specială sunt rotoarele aproape verticale. Tuburile de probă sunt doar ușor rotite aici, între aproximativ 7,5 ° și 9 °. Distanța de separare scurtată rezultată, spre deosebire de rotoarele verticale normale, reduce timpul de separare sau centrifugare. O ușoară înclinație împiedică soluția și orice benzi de gradient pe care le poate conține să intre în contact cu peleta la sfârșitul cursei de centrifugare.

Peletizare ușoară

Granularea simplă este una dintre cele mai simple și mai utilizate tehnici de centrifugare. Este de obicei utilizat ca parte a unui proces pentru recoltarea celulelor sau pentru izolarea materialului precipitat. Peletizarea (sedimentarea) se referă la separarea materialelor sub formă de particule și non-particule. Materialul sub formă de particule se colectează la baza tubului de probă în timpul centrifugării și formează o peletă solidă (sediment) acolo după un timp de centrifugare corespunzător. Granularea simplă reprezintă de obicei o etapă timpurie în procesele complexe și în mai multe etape pentru purificarea particulelor. Supernatantul sau granula este apoi aruncat sau procesat în continuare.

În timpul purificării proteinelor (articolul principal , purificarea proteinelor ), de exemplu, proteina care trebuie examinată este prima z. B. supraexprimat în bacterii care sunt cultivate într-o soluție nutritivă. O centrifugă cu volum mare este utilizată pentru a „recolta” bacteriile din soluție. Bacteriile formează o peletă la baza tubului. După eliminarea soluției nutritive supernatante, peleta este procesată în continuare. Când veziculele extracelulare (EV), de exemplu exosomii , sunt purificate , totuși, peleta este aruncată și EV-urile sunt obținute de la supernatant. În etapele ulterioare de purificare a ambelor exemple, sunt utilizate de obicei metode de centrifugare suplimentare, cum ar fi centrifugarea diferențială și gradientul de densitate.

Peletizare diferențială

În granularea diferențială (cunoscută și sub numele de centrifugare diferențială ), mai multe curse individuale de centrifugare sunt strânse împreună. Această metodă este adesea utilizată pentru separarea fracțiilor subcelulare (de exemplu, organite celulare, fracționarea celulelor articol principal ) . Mai întâi, un țesut sau o suspensie bacteriană se omogenizează prin măcinare sau zdrobire, de exemplu folosind o presă franceză (articolul principal presă franceză ), și apoi plutește cu o soluție tampon fiziologică. Acest omogenat este apoi supus unor etape succesive de centrifugare cu accelerație crescândă. După fiecare etapă de centrifugare, supernatantul este separat cu grijă de peletă și supus unei alte curse de centrifugare. Odată cu accelerarea crescândă, particulele din ce în ce mai mici pot fi peletizate. În procedura efectuată de obicei pentru purificarea organelor celulare, nucleele celulare și părți ale membranei plasmatice și celule întregi, non-fragmentate, ar fi conținute în sediment după prima rundă (10 minute, aproximativ 600 g ) . După centrifugare suplimentar pașii cu supernatantul respectiv, peleta al patrulea termen (60 min, 10 ⁵ g ) ar contine foarte mici componentele solubile ale citoplasmei , cum ar fi enzime , lipide și substanțe cu masă moleculară mică , cum ar fi sărurile și zaharuri . Fracțiile celulare obținute în acest mod conțin întotdeauna mai multe tipuri de particule. Acestea sunt adesea purificate din fracțiile celulare individuale prin centrifugare ulterioară cu gradient de densitate.

Centrifugare cu gradient de densitate

Gradientul de densitate se aplică, de exemplu, pentru purificare ulterioară și separarea fracțiilor particulelor de centrifugare diferențială. Spre deosebire de acest proces, aici se folosește un solvent cu un gradient de densitate. Acest lucru permite separarea mai bună a fracțiunilor de macromolecule. La solvent se adaugă o substanță (de exemplu zaharoză ), a cărei concentrație se modifică în raport cu distanța față de axa de rotație. Acest lucru are ca rezultat o densitate variabilă dependentă de locație în tubul de probă, un gradient de densitate care acționează asupra macromoleculelor care urmează să fie fracționate în timpul centrifugării. Acest lucru creează benzi clar separate, cu fracțiuni de particule care pot fi utilizate în alte scopuri pregătitoare sau analitice. Cele mai importante tipuri de centrifugare în gradientul de densitate sunt sedimentarea în zone și centrifugarea izopicnică.

Sedimentarea zonei

Sedimentarea în zone este utilizată pentru a separa particulele în funcție de mărimea lor, de exemplu tipurile de celule, organele celulare, dar și proteinele. În această metodă, formarea benzilor depinde de durata cursei de centrifugare, care este întreruptă înainte de stabilirea unei stări de echilibru între solvent și particulele probei.

În cazul sedimentării zonei, gradientul este acoperit cu proba care trebuie separată. Densitatea suspensiei eșantionului este mai mică decât cea a gradientului, astfel încât benzile (zonele) de particule diferite migrează cu o separare relativ bună în timpul centrifugării ulterioare. După un timp de sedimentare adecvat, benzile pot fi recoltate, de ex. B. prin pipetare a supernatantului sau prin îndepărtarea benzii cu ajutorul unei canule. Gradienții plate sunt utilizați în cea mai mare parte pentru sedimentarea zonei; adică există doar o ușoară diferență de densitate între partea superioară și inferioară a tubului.

Gradientul de densitate este important în formarea sau menținerea benzilor din următoarele motive. Accelerația centrifugă crește proporțional cu distanța față de axa de rotație. Adică, viteza de sedimentare care acționează asupra particulelor crește spre fundul tubului de centrifugare. Fără gradienți, acest lucru duce la divizarea și suprapunerea benzilor de particule. Gradientul contracarează creșterea vitezei de sedimentare în două moduri. În primul rând, densitatea și, astfel, vâscozitatea gradientului crește, de asemenea, cu distanța de la axa de rotație. Creșterea rezultată a coeficientului de frecare contracarează viteza de sedimentare a particulelor. În al doilea rând, odată cu creșterea densității gradientului, crește și flotabilitatea care acționează asupra particulelor, ceea ce contracarează și creșterea vitezei de sedimentare.

Pentru acest tip de centrifugare se utilizează, de obicei, rotoare cu cupă oscilantă sau rotoare verticale (Fig. 3). Rotoarele cu unghi fix sunt mai puțin adecvate deoarece, datorită coliziunii macromoleculelor cu peretele tubului centrifugii, benzile care migrează netulburate cu greu se pot dezvolta.

Un exemplu tipic de aplicare este separarea subunităților ribozomale într-un gradient de densitate a zaharozei. Pentru separarea diferitelor tipuri de celule, de ex. B. Limfocitele sau organitele celulare sunt utilizate în principal gradienți Ficoll sau Percoll.

Centrifugare izopicnică

În centrifugarea izopicnică, separarea particulelor se bazează pe densitatea acestora. Este centrifugat până când s-a stabilit un echilibru de sedimentare pentru separarea particulelor. Tipurile de particule au format apoi benzi la poziții în gradient care corespund densității lor plutitoare. Particulele nu ar migra mai departe în mediu chiar și cu timpi de centrifugare mai lungi.

Gradientele autoformante și preformate sunt utilizate pentru separarea izopicnică a macromoleculelor. Gradienții pentru particule mai mari, cum ar fi celulele sau organele sunt de obicei preformate, ceea ce înseamnă că sunt deja în echilibru de sedimentare. Această metodă poate fi utilizată, de exemplu, pentru a separa particulele dintr-un omogenat. Un gradient de densitate mai ales liniar , de ex. B. se dă o soluție de zaharoză și se suprapune cu soluția de probă.

Gradienții cu auto-formare sunt de obicei folosiți pentru a separa macromoleculele și alte particule mici. Gradientul este aici în timpul ciclului de centrifugare cu debutul sedimentării mediului de gradient, z. B. soluție salină concentrată. Acest tip de centrifugare izopicnică este utilizat, de exemplu, pentru purificarea ADN-ului . Oferă ADN plasmidic foarte pur . În gradientul de clorură de cesiu , acizii nucleici sunt separați pe baza densității lor. În prezența bromurii de etidiu, ADN-ul cromozomial poate fi separat de ADN-ul plasmidic. Bromura de etidiu intercalează între firele de ADN, dar se atașează mult mai puternic de ADN-ul plasmidic. Acest lucru îi conferă o densitate mai mare și formează o bandă care este mai departe de axa de rotație decât cea a ADN-ului cromozomial.

În centrifugarea izopicnică, mediul de gradient este suprapus cu proba, amestecat sau proba este introdusă în partea de jos a gradientului (separarea de flotație). Această din urmă metodă este utilizată pentru separarea diferitelor tipuri de lipoproteine , precum și pentru subfracționarea diferitelor tipuri de membrane.

Alegerea rotorului depinde de tipul probei. Pentru particulele mai mari, cele mai bune rezultate se obțin cu rotorele cu cupă oscilantă. Rotoarele cu unghi fix sunt deosebit de potrivite pentru separarea macromoleculelor, deoarece obțin cea mai bună rezoluție.

Tabelul 1: Tipuri de rotori și aplicarea acestora

Particulă	solvent	Procedură	Tip rotor
ADN, ARN, proteine, macromolecule	Săruri (CsCl, Cs 2 SO 4 , KI, ..)	centrifugare izopicnică	Rotoare cu unghi fix
Organite, membrane	Zaharoza, Optiprep, Nycodenz	centrifugare izopicnică	Rotoare cu cupă oscilantă
Separarea tipului de celulă	Percoll + tampon osmotic, Nycodenz, Optiprep	Sedimentarea zonala	Rotoare oscilante, rotoare verticale

Ultracentrifugare analitică

Cu ultracentrifugarea analitică , mișcarea analiților în câmpul gravitațional este înregistrată online spectroscopic . Trebuie făcută o distincție între două experimente de bază. Cursul de sedimentare asigură coeficientul de sedimentare . În cursul de echilibru, există un echilibru de concentrație statică, ca și în echilibrul hidrostatic , din care masa molară a macromoleculei poate fi determinată cu o precizie ridicată B. prin centrifugare cu gradient de densitate .

Exemple de utilizare în biochimie

• pentru izolarea lipoproteinelor (ultracentrifugare cu gradient de densitate)
• pentru concentrarea proteinelor cu o masă molară mare , cum ar fi microsomii (ultracentrifugare diferențială)
• ca o etapă de curățare pentru izolarea virușilor și a particulelor de tip virus care sunt necesare pentru cercetare sau ca materii prime ( antigene ) pentru producerea testelor de diagnostic (ultracentrifugare cu gradient de densitate)
• Determinarea coeficienților de sedimentare și a greutăților moleculare ale macromoleculelor

Dovezi individuale

1. ↑ ^{a b c d e f g h} Gerold Adam, Peter Läuger, Günther Stark: chimie fizică și biofizică (=  manual Springer ). Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg 2009, ISBN 978-3-642-00423-0 , doi : 10.1007 / 978-3-642-00424-7 ( springer.com ). 
2. ↑ ^{a b c d e f} Beckman Coulter Ultracentrifuge Catalog Products_CENT-1088CAT08.15-A
3. ↑ Benjamin Rivnay, Henry Metzger: Utilizarea aparat Airfuge pentru analiza și prepararea receptorilor încorporați în lipozomi: Studiile efectuate cu receptorul pentru imunoglobulina E . În: Biochimie analitică . bandă 130 , nr. 2 , 15 aprilie 1983, ISSN  0003-2697 , pp. 514-520 , doi : 10.1016 / 0003-2697 (83) 90626-7 ( sciencedirect.com [accesat la 30 mai 2020]). 
4. ^ ^{A b c d e} D Rickwood: Centrifugarea preparativă: o abordare practică . În: Educație biochimică . IRL Press, 1992. 
5. ↑ ^{a b c d e f} David Rickwood: Tehnici de centrifugare . În: Enciclopedia științelor vieții . John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, Marea Britanie 2001, ISBN 978-0-470-01617-6 , pp. a0002704 , doi : 10.1038 / npg.els.0002704 ( wiley.com ). 
6. ↑ ^{a b} Din omniadm: selecția corectă a rotorului pentru o centrifugare optimă | Blogul OMNILAB. 26 februarie 2020, accesat la 30 mai 2020 (germană). 
7. ↑ ^{a b} Claudia Simone Plüisch, Brigitte Bössenecker, Lukas Dobler, Alexander Wittemann: Centrifugarea rotorului zonal revăzută: noi orizonturi în sortarea nanoparticulelor . În: RSC Advances . bandă 9 , nr. 47 , 29 august 2019, ISSN  2046-2069 , p. 27549–27559 , doi : 10.1039 / C9RA05140F ( rsc.org [accesat la 30 mai 2020]). 
8. ↑ CB Reimer, RS Baker, RM van Frank, TE Newlin, GB Cline, NG Anderson: Purificarea unor cantități mari de virus gripal prin centrifugare cu gradient de densitate. Ed.: Jurnal de virologie. Prima ediție. Nu. 6 , 1967, p. 1207-1216 . 
9. ↑ ^{a b} Beckman Coulter JCF-Z Manual și rotor cu flux continuu manual
10. ↑ Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Graça Raposo, Aled Clayton: Izolarea și caracterizarea exozomilor din supernatanții culturii celulare și fluide biologice . În: Protocoale actuale în biologia celulară . bandă 30 , nr. 1 , martie 2006, p. 3.22.1–3.22.29 , doi : 10.1002 / 0471143030.cb0322s30 ( wiley.com [accesat la 30 mai 2020]). 
11. ↑ Anurag Purushothaman: Exosomi din mediu condiționat de cultură celulară: izolare prin ultracentrifugare și caracterizare . În: Matricea extracelulară: metode și protocoale (=  Metode în biologie moleculară ). Springer, New York, NY 2019, ISBN 978-1-4939-9133-4 , pp. 233-244 , doi : 10.1007 / 978-1-4939-9133-4_19 . 
12. ↑ Susanne J. Bauman, Meta J. Kuehn: Purificarea veziculelor cu membrană exterioară din Pseudomonas aeruginosa și activarea lor a unui răspuns IL-8 . În: Microbi și infecție . bandă 8 , nr. 9-10 , august 2006, pp. 2400–2408 , doi : 10.1016 / j.micinf.2006.05.001 , PMID 16807039 , PMC 3525494 (text complet gratuit) - ( elsevier.com ). 
13. ^ ^{A b} John Graham: Pregătirea fracțiilor subcelulare brute prin centrifugare diferențială . În: The Scientific World JURNAL . bandă 2 , 2002, ISSN  1537-744X , p. 1638–1642 , doi : 10.1100 / tsw.2002.851 , PMID 12806153 , PMC 6009713 (text complet gratuit) - ( hindawi.com ). 
14. ↑ SJ Garger, OM Griffith, LK Grill: Purificarea rapidă a ADN-ului plasmidic printr-o singură centrifugare într-un gradient în două etape de clorură de cesiu-bromură de etidiu . În: Comunicări de cercetare biochimică și biofizică . bandă 117 , nr. 3 , 28 decembrie 1983, ISSN  0006-291X , pp. 835-842 , doi : 10.1016 / 0006-291X (83) 91672-8 ( sciencedirect.com [accesat la 30 mai 2020]). 
15. ↑ https://www.axis-shield-density-gradient-media.com/Isolation%20of%20cells.pdf
16. ↑ https://axis-shield-density-gradient-media.com/Leaflet%20Nycodenz.pdf